TriptolideandCelastrolLoadedSilkFibroinNanoparticlesShowSynergisticEffectagainstHumanPancreaticCancerCells

本文于年8月发表在Nanoscale（IF：6.）

丝素蛋白（SF）是一种由蚕茧再生的天然产物，具有多种独特的特性，包括生物相容性，可调节的生物降解，稳定作用，水基加工和多种材料形式，使其成为掺入各种药物载体的潜在材料提供多种治疗药物。

方法及结果

1.SF蛋白提取

将蚕茧切成小块，在0.02MNa2CO3中脱胶两次，每次30分钟，然后用去离子水彻底冲洗。风干后，溶解在三元体系CaCl2-CH3CH2OH-H2O（1∶2∶8，摩尔比）中，在75℃下持续搅拌2小时，4小时和8小时后，rpm离心5分钟，上清液在Viskase透析膜（MWCODa）中用去离子水渗析3天，以去除盐和乙醇，再1rpm离心15分钟后，使用NanoDrop?/c分光光度计测定制备的丝素蛋白溶液的浓度。分子量通过SDS-PAGE（8%分离胶和5%浓缩胶）表征。

2.SF纳米粒子的制备

将TPL和CL分别以一定的浓度溶解于丙酮:乙醇(3:2,v/v)中，将配制好的TPL或CL溶液分别滴入SF溶液中，轻轻不断搅拌，-20°C的冰箱中孵育16小时，40°C的温水中快速解冻，1rpm离心15分钟，去离子水洗涤三次收集纳米颗粒，以10％的振幅超声2分钟以分散聚集的丝球，用5％（w/v）海藻糖作为冷冻保护剂冻干，该冻干纳米颗粒制剂保存在2-8°C。使用相同的方法制备了罗明丹-B-异硫氰酸酯（RTIC）-SFNP（RITC-SFNPs），空白的SFNP（Blank-SFNPs）。

Taguchi的L9正交阵列实验设计用于优化TPL-SFNP和CL-SFNP的配方参数。采用三因素、三水平设计来研究配方变量的相互作用和二次效应，选择SF，TPL和CL的初始浓度以及用于配方优化的有机/SF溶液的体积比。表S1中显示了为配方优化选择的三个因素及其水平。使用Design-Expert?软件分析结果。

3.纳米粒子的表征

（1）动态光散射检测器测量Blank-SFNPs,TPL-SFNPs,CL-SFNPs粒径和zeta电位

（2）透射电子显微镜观察Blank-SFNPs,TPL-SFNPs,CL-SFNPs形貌

（3）傅里叶红外变换光谱测定FTIR光谱和β折叠含量

（4）HPLC测量载药量（DL）、包封效率（EE）和药物累积释放曲线

4.安全性评价

4.1溶血实验

以TritonX-为阳性对照，以PBS为阴性对照，观察Blank-SFNPs,TPL-SFNPs,CL-SFNPs,TPL-SFNPs+CL-SFNPs的溶血作用。

4.2细胞毒性实验

观察不同浓度的Blank-SFNPs对HGF-1,HEK-,PANC-1,MIAPACA-2细胞活性的影响。

5.体外细胞摄取-激光共聚焦和流式细胞仪检测

6.联合作用指数的测定

为了评估TPL和CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的组合作用，将预孵育的MIAPaCa-2和PANC-1细胞与各种浓度的药物和载有药物的SFNPs共处理72小时。根据CompuSyn软件的建议和获得的IC50值，将实验设计为恒定的组合比。然后通过MTS测定细胞活力，通过CompuSyn软件进行分析，该软件遵循中值效应原理确定组合指数（CI）值。计算组合指数的公式为

CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2

其中（Dx）1和（Dx）2表示两种药物单独使用使生长抑制率达X时的浓度，（D）1和（D）2是两药联合使用使生长抑制率达X时的浓度。结合指数（CI）值1，=1和1分别表示协同作用，累加作用和拮抗作用。

7.细胞凋亡实验

使用流式细胞术探讨TPL-SFNPs联合CL-SFNPs对MIAPaCa-2和PANC-1细胞凋亡的影响。

总结

本文将雷公藤甲素和雷公藤红素装载到丝素蛋白上形成了纳米颗粒，探讨该颗粒对胰腺癌的治疗作用。主要测量了该纳米颗粒的粒径、zeta电位、包封率、载药量和药物释放曲线，并通过体外溶血实验和细胞毒性实验确定丝素蛋白无毒性，通过激光共聚焦和流式对该颗粒的摄取进行了观察，发现该颗粒主要在胞质和细胞核中分布，克隆实验发现，与单个药物相比，该颗粒对胰腺癌细胞具有明显的抑制增殖作用，并借助细胞实验测量了联合作用指数，结果表明雷公藤甲素和雷公藤红素被装载到丝素蛋白上后具有协同抑制胰腺癌细胞的作用，而不是累积作用，最后通过细胞凋亡实验发现该颗粒可明显促进胰腺癌细胞的凋亡过程。综上，与单个药物相比，雷公藤甲素和雷公藤红素被装载到丝素蛋白形成的纳米颗粒对胰腺癌细胞具有明显的协同治疗作用。

文章中蛋白的分子量分布较广，并不是单一蛋白，但没有测定蛋白结构，而是将药物的包封率、载药量和释放曲线进行测定，文章整体思路偏于材料方面，我们可以借鉴此思路，测量甘草蛋白对芍药苷的包封率、载药量和药物释放曲线，并结合体内外药效实验和内吞机制来开展下一步的实验。