我们将具有抗氧化、抗钙化及抗炎等多种生物学活性的天然产物原花青素（PC）与生物源性脱细胞支架材料猪小肠黏膜下层（SIS）通过交联反应制备PC-SIS修复补片材料。PC-SIS在体外呈现出良好的生物相容性及力学稳定性；兔膀胱全层缺损修复实验表明PC-SIS补片可有效促进膀胱平滑肌的再生，对于膀胱功能化重建意义重大。

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研究内容简介

交联是提高材料力学性能及稳定性的常用工艺手段，对于SIS而言，交联可以通过表面修饰的方法扩大其应用范围。PC作为一种生物源性交联剂，具有抗氧化、抗钙化及抗炎等多种生物学功能，并且其代谢路径及生物安全性均已被验证。PC的酚羟基可以与胶原的酰胺羰基结合形成氢键，提高材料的力学稳定性。基于此，我们提出PC交联剂的引入可以提升SIS的生物学特性，并赋予其新功能，使其更符合临床对膀胱修复补片的要求。在本研究中，我们制备了不同交联浓度的补片材料，在体外评价了其生物学性能，并进一步探索其作为兔膀胱全层缺损补片的应用潜能。

该研究以SIS为基底材料，应用不同浓度的PC对其进行表面修饰及改性。为了筛选合适的交联剂浓度，在体外进行了交联度、力学性能及生物相容性等表征及评价，结果表明0.5mg/ml（PC-SIS1）和1mg/ml（PC-SIS2）既可以形成有效交联且具有良好的生物相容性（Fig.1）。

Fig.1OptimalcrosslinkingconcentrationofPCinvitro.(A)Grossobservationandultrastructureofthematerialunderascanningelectronmicroscope(SEM)ofallgroups.Scalebars=μm.(B)DegreeofcrosslinkingofPC-SISascalculatedbasedontheNinhydrinassay.*P0.05.#P0.05.(C)Fouriertransformsinfraredspectral(FTIR)analysis.(D)Measurementofwatercontactangleofthematerialswithdifferentconcentrationofcrosslinker.*P0.05.(E)Characterizationofthemechanicalpropertiesofvariousmaterials.*P0.05.#P0.05.(F)CellproliferationinvariousgroupsasdetectedwithaCCK-8assay.Datawaspresentedasmean±S.D.*P0.05.#P0.05.(G)ViabilityofthecellonvariousmaterialsasassessedbyCalceinAM/PIstaining.Scalebars=50μm.(H)Subcutaneousimplantationofrepresentativescaffolds3weekspostoperatively.★Indicatesscaffolds,→Indicatesinflammatorycells.Scalebar=50μm.

我们进一步评价交联材料对膀胱平滑肌细胞的生物学特性的调控效应，我们将原代提取的膀胱平滑肌细胞接种于不同交联浓度的材料上，对其骨架形态、微观形貌及基因表达水平进行分析表征。细胞的表观及微观形貌表明PC-SIS材料更利于平滑肌细胞“簇向”生长，且维持平滑肌细胞功能的基因表达水平显著高于SIS组（Fig.2）。

Fig.2EffectofcrosslinkingonR-B-SMCs.(A)F-actinstainingshowedthecytoskeletononthedifferentmaterialsafter5daysculture.Scalebars=50μm.(B)SEMindicatedtheultrastructureofR-B-SMCsonthedifferentcrosslinkermaterialsafter5daysculture.Scalebars=5μm10μm.(C)QuantitativeReal-TimePCRdetectedthesmoothmuscle-relatedgeneexpressiononthedifferentmaterialsafter5daysculture.*P0.05.

为了进一步验证该新型活性生物材料在膀胱组织工程中的应用潜能，我们构建了占兔膀胱总面积1/3的全层缺损修复模型，并应用不同交联浓度的材料进行体内修复评价。术后3个月，取材后进行形态学及功能学评价，结果显示，修复区上皮组织均可实现连续再生，且上皮功能性标记物UPK-III在各组均有表达，相较于单纯SIS组，交联材料显著促进了平滑肌组织的再生。同时，修复区均可观察到血管及神经的再生（Fig.3）。膀胱尿动力学功能评价表明PC-SIS能够显著增强膀胱顺应性（见链接原文）。

Fig.3Immunofluorescencestainingandquantitativeassessmentsoftherepairedbladderdomesintheshamandexperimentalgroupsat12Wafterthesurgery.(A)Expressionofurothelial-associatedmarkersAE1/AE3andUroplakin-III.UE,urothelium.Scalebars=μm.(C)Expressionofsmoothmuscle-specificmarkersα-SMAandMyosin.SM,smoothmuscle.Scalebars=μm.(E)Theinnervationmarker,synaptophysin(SYP38).ArrowsrepresentedSYP38+.Scalebars=50μm.(G)TheendothelialmakerCD31.VdenotesCD31+vessels.Scalebars=50μm.Specificmarkerexpressionwasindicatedbyred(Cy5labeling)andDAPIstaining(blue)marksthenucleus.(B,DF)Percentageofpositivearearelativetototalareaare